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            淺談串聯質譜法檢測類固醇激素(上:方法學對比篇)

            認識類固醇激素

            類固醇激素是由膽固醇經一系列酶催化代謝產生的一類脂溶性小分子激素,結構上都是環戊烷多氫菲衍生物,又稱類甾類激素。根據功能性質,一般將其分為腎上腺皮質激素和性激素兩大類。類固醇激素通過內分泌系統調節人體新陳代謝,同時對生長、發育、生殖及維持人體內環境穩定等方面起著重要的調節作用。

            類固醇激素在人體內的濃度都很小,一般是ng/ml 到pg/ml的數量級,而且與年齡、性別、生理周期、晝夜變化等都有很大的關系。因此類固醇激素對檢測方法的檢測限及靈敏度和特異性有極高的要求。


            Johannes M.W. et al, The role of liquid chromatography–tandem mass spectrometry in the clinical Laboratory, Journal of Chromatography ,2012.

            類固醇激素檢測:串聯質譜法VS.傳統免疫法

            傳統方法

            1. 準確度低許多激素具有相似的化學結構,因此對方法的選擇性(或者特異性)要求高;免疫法測定由于交叉反應影響診斷的準確性。

            美國病理學家協會(CAP)向1100家臨床實驗室分發3種不同濃度的睪酮樣本以評估不同免疫學方法,研究結果顯示實驗室間用相同免疫學方法檢測樣本1(代表女性和兒童患者)變異系數(CV)為13%-32%,差異達2-6倍;樣本2(代表性腺功能減退男性患者)最高檢測值與最低檢測值相差32 ng/mL。

            該情況導致在利用免疫法檢測女性、兒童及雄性激素分泌障礙的男性患者樣本時,其結果的可信度很低,幾乎沒有任何臨床價值。



            2. 靈敏度低(檢測限高:兒童、男性、絕經及芳香酶抑制劑治療的婦女體內雌二醇水平很低;性腺功能減退的男性、女性和兒童體內濃度睪酮水平很低,直接免疫法檢測限值無法滿足這些樣本的準確檢測。



            3. 低通量:在相關內分泌疾病的篩查工作中,往往需要同時關注相關代謝通路上的多種類固醇激素,以系統的了解人體的激素代謝狀態,判斷相關通路上的各代謝物或相關酶的活性。而傳統免疫檢測方法的抗原-抗體結合的工作原理使得免疫方法一般一次分析只能檢測一種或一類物質,從而在檢測通量上存在較大的局限性。

            比如先天性腎上腺皮質增生癥(CAH)的診斷,可能需要同時檢測17-羥孕酮、11-脫氧皮質醇、雄烯二酮、皮質醇等一系列的激素,才能對CAH代謝障礙的具體類型準確區分。


            Soldin SJ , Solidin OP. Steroid hormone analysis by tandem mass spectrometry ,Clin Chem ,2009.


            串聯質譜法

            隨著液相色譜串聯質譜(LC-MS/MS)技術的發展,其逐漸成為國內外臨床研究的熱點。內分泌領域涉及有關質譜檢測方法的文獻每年增加超過100篇,并且已逐漸由科研應用轉型供臨床內分泌診療應用。

            1.  早在2003年,Clinical Chemistry就刊登社論指出:與其用免疫學方法評估女性體內的睪酮水平,不如猜測來得更準確、更快捷、且對患者無創傷。傳統免疫法檢測類固醇激素的臨床應用受到質疑。


            同一時期有研究對10種免疫學方法與質譜法進行比較,結果發現不僅免疫學方法之間結果差異較大,且睪酮濃度低于10 nmol/L時,免疫學方法與質譜法結果差異有統計學意義。


            另外一方面,對于睪酮的測定,LC-MS方法的檢測下限可達2.5 ng/ml ,同時保持良好的室內、室間的穩定性(CV值<2%)。


            2.   在正常男性血漿中的雌酮和雌二醇濃度分別是<68 pg/ml 43 pg/ml,免疫法檢測經常會出現假陽性的結果,但是LC-MS/MS法檢測雌酮和雌二醇的檢測限可以達到5pg/ml,極大程度的避免了假陽性誤差。


            2007年的一篇研究,監測了乳腺癌患者使用芳香酶抑制劑治療后體內雌二醇水平,結果顯示質譜法檢測限值顯著低于免疫學方法,且檢測結果的穩定性明顯高于免疫學方法。


            國際認可

            2013年美國內分泌學會在臨床內分泌與代謝雜志(Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism)發表聲明,宣布2015年開始將只接受由質譜方法檢測的研究結果。同時該雜志主編發表社論要求以后投稿的有關性激素的研究論文必須是基于質譜檢測的數據,這樣才能獲得可靠的結果。


            方法學對比

            激素特點

            免疫法

            質譜法

            某些激素低至pg/ml

            低分子量物質檢測范圍窄

            靈敏度高,低值結果穩定

            激素結合蛋白

            受蛋白結合干擾

            預處理去除蛋白

            結構相似干擾物

            交叉反應

            特異性高

            系列前體和代謝物

            建立新目標化合物的檢測方法相對困難

            相對開發簡單,可實現多物質同時檢測


            結語

            相比于傳統的免疫法檢測,液相色譜串聯質譜分析法具有低檢測限和高靈敏度及高特異性的優勢,一次進樣同時定量檢測多種類固醇激素,大程度上規避了傳統檢測方法的諸多問題與不足。因此LC-MS/MS是類固醇激素檢測最佳選擇。



            參考文獻


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